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大豆分离蛋白（SPI）作为一种优质的植物蛋白，具有凝胶性、乳化性和发泡性等多种功能活性。其中，含量最多的7S和11S亚基与SPI功能活性紧密相关。SPI在食品加工等领域应用广泛，但其对pH值较为敏感，在等电点附近稳定性较差。以植物蛋白为体系的饮料在生产和贮藏过程中最常见的问题是蛋白沉淀等不稳定现象，严重影响产品品质。
来源于天然原料的亲水性胶体（魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶等）应用在蛋白饮料中，在满足食品清洁标签的同时，也改善产品增稠稳定的特性。银耳中富含的银耳多糖（TFP）除了以上特点，还具有较好的持水性和乳化稳定性。研究发现TFP还具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、免疫调节等多种生物活性。因此，将TFP应用到富含蛋白的饮料体系中，不仅能达到增稠稳定的目的，还能增加产品的功能活性。然而，目前鲜有关于TFP与蛋白质相互作用的研究。广西大学轻工与食品工程学院的龙 慧、李 祎、夏 宁*等旨在通过对TFP与SPI相互作用的条件和影响因素的研究，探讨两者的相互作用机制，为实现新功能性多糖在植物蛋白饮料中的应用提供一定理论基础。
1、SPI和TFP的组成
实验测得SPI的蛋白质相对含量为93.32%。在TFP中，总糖、糖醛酸和蛋白质的相对含量分别为93.96%、25.53%和0.23%。
2、SPI-TFP复合凝聚相行为分析
pH值对SPI-TFP复合凝聚的影响
由图1可知，与其他蛋白质-多糖体系一样，SPITFP混合液（1∶1，m/m）在酸化过程中由于浊度的变化产生了4 个离散相。根据浊度滴定曲线，可确定复合体系的可溶性复合点（pH c ）和不可溶性复合点（pH φ ）。pH c 为浊度曲线斜率首次出现变化时的pH值，pH φ1 为浊度曲线斜率突然增大时对应的pH值，pH opt 为浊度最大时对应的pH值，pH φ2 为浊度曲线斜率降到稳定时对应的pH值。利用复合体系的pH c 、pH φ 及蛋白质等电点可将复合体系分为4 个区域：I）共溶区：当pH值大于pH c （6.4）时，SPI和TFP都带负电荷，两者由于静电排斥作用而各自以单分子形态稳定存在于溶液中，从而不能形成复合凝聚体。II）可溶性复合凝聚体区：当pH值降至pH c 时，复合体系的浊度开始逐渐增大，表明SPI-TFP复合凝聚体开始形成。在pH 5.8～6.4，SPI和TFP均带负电荷，此时复合凝聚体的形成是由于SPI上与TFP电荷相反的局部斑块间的络合。在大麻分离蛋白与阿拉伯胶相互作用的研究中也有类似发现。III）不溶性复合凝聚体区：当pH值降至pH φ1 （5.8）时，不可溶性复合凝聚体的出现使体系发生宏观的相分离。随着酸化的进行，SPI和TFP的静电相互作用在pH opt1 （4.3）和pH opt2 （3.3）处达到最强。SPI主要组成蛋白包括7S球蛋白和11S球蛋白，其等电点分别为4.8和6.4，这与2 次浊度峰值的出现有关。表明在SPI-TFP复合凝聚体中，SPI与TFP质量比为1∶1时，TFP能分别与这2 种球蛋白发生相互作用，使其分别在pH 4.3和pH 3.3处产生最大的聚集。IV）共溶区：随着pH值降低，复合凝聚体逐渐解离。在pH φ2 （2.2）时，SPI和TFP相互作用终止，复合凝聚体完全发生解离，体系的浊度降低且保持不变。
SPI和TFP质量比对SPI-TFP复合凝聚的影响
由图2a可知，随着体系中TFP比例的增大，SPI-TFP混合液的吸收峰变宽，最大吸收峰逐渐降低。在豌豆分离蛋白与黄芩胶的复合凝聚研究中也发现了类似现象。在SPI-TFP混合液中，当SPI∶TFP＜1时，SPI与TFP之间发生了弱相互作用，体系浊度较低。体系中由于过量阴离子基团的存在，聚合物之间存在强烈的静电斥力，不利于凝聚的发生。当SPI∶TFP＞1时，体系中存在较多SPI，可与TFP链结合的SPI增多，体系浊度值较高。由图2b可知，随着体系中TFP比例的增大，形成复合凝聚体的关键pH值发生变化。在SPI-TFP混合液中，当SPI∶TFP＞1时，TFP比例的增大使得SPI表面的正电荷能结合的负电荷增加，在一定程度上促进了复合物的形成，所以复合凝聚的pH c 和pH φ1 向高pH值方向移动。当SPI∶TFP＜1时，随着体系中TFP比例的增大体系的负电荷增多，需要更多正电荷进行中和，SPI分子在较低pH值下带的电荷较高，因而pH φ1 向低pH值方向移动。
离子浓度对SPI-TFP复合凝聚的影响
由图3a可知，在SPI-TFP离子混合液（1∶1，m/m）中，随着NaCl浓度增大，复合体系浊度的最大值呈现先增大后减小的趋势。在低浓度的盐离子下，复合凝聚现象的出现在一定程度上能增强SPI与TFP的溶解，从而促进两者相互作用的发生。NaCl浓度为20 mmol/L时，复合体系浊度的峰值最大，说明此时盐离子对SPI和TFP复合的促进作用最大。当NaCl浓度大于20 mmol/L时，复合体系浊度的峰值开始减小，说明此时盐离子开始抑制SPI与TFP之间的复合作用。由图3b可知，在SPI-TFP离子混合液（1∶1，m/m）中，随着NaCl浓度增大，复合物形成的关键pH值（pH c 、pH φ1 、pH opt ）总体向更高的pH值移动，表明Na+中和了部分TFP羧基基团所带的负电荷。
3、SPI-TFP复合凝聚的Zeta电位分析
如图4a所示，TFP储备液在pH 2.0～7.0范围内都带负电荷；当pH＞3.5时，TFP储备液电位的绝对值均大于30 mV，表明TFP在溶液中充分溶解，溶液处于稳定状态。在SPI储备液中，当pH值为4.7左右时，溶液的Zeta电位为0，这与文献报道的等电点一致。pH值为2.0～7.0时，SPI-TFP混合溶液（1∶1，m/m）的电位值在SPI与TFP储备液之间；当pH＜4.7时，带相反电荷的SPI和TFP之间会形成凝聚体。
由图4b可知，SPI-TFP混合溶液随着TFP比例的增加，SPI与TFP在低pH值（pH 2.0）发生中和，提高TFP的添加比例，会使溶液的负电荷增加。因此，形成凝聚体需要溶液提供更多正电荷，体系的电荷中和点向更低的pH值方向移动。在pH 5.0～7.0，所有混合溶液的Zeta电位值变化相对较小；当pH＜5.0时，SPI-TFP混合液的Zeta电位值迅速增加，SPI-TFP混合物的电荷中和点与pHopt（pH 3.0～4.0）相近。
由图4c可知，复合物形成区域（pH＞4.5）SPI-TFP体系的Zeta电位绝对值随NaCl浓度的增加而降低。这与NaCl的静电屏蔽效应有关，在较高的离子强度下，SPI与TFP间的静电相互作用由于屏蔽了两种生物聚合物上的带电活性位点而减弱，从而导致过量的羧基不能与阳离子氨基结合，抑制了SPI与TFP的相互作用，降低了体系的稳定性。
4、SPI-TFP复合凝聚的荧光光谱分析
由图5可知，在相同pH值条件下，与SPI溶液相比，SPI-TFP混合液（1∶1，m/m）的最大荧光强度降低，对应的波长发生红移（由333 nm移动到335 nm）。SPI-TFP复合物的形成可能改变了色氨酸残基的微环境，猝灭SPI固有荧光使荧光强度下降，表明疏水相互作用参与了复合物的形成。
5、SPI-TFP复合凝聚的傅里叶变换红外光谱分析
如图6a所示，加入TFP后，在pH值相同条件下，SPI酰胺I带从1 660 cm －1 红移至1 650 cm －1 、酰胺II带的特征峰从1 530 cm －1 蓝移至1 540 cm －1 ，说明TFP与SPI发生了疏水相互作用，引起了SPI二级结构的变化。与SPI储备液相比，SPI-TFP混合液的酰胺A带吸收峰的强度和位置均发生改变，表明SPI与TFP间存在氢键相互作用。
由图6b可知，与SPI储备液相比，SPI-TFP混合液的α-螺旋和β-折叠的总相对含量有所增加，无规卷曲的相对含量降低。α-螺旋和β-折叠属于相对规则的构象，表明添加TFP后SPI的有序结构增加，刚性增强，也进一步证明了TFP能够抑制SPI的聚集。
6、pH值对SPI-TFP复合凝聚微观结构的影响
由图7可知，pH 7.0时，SPI储备液和SPI-TFP混合液（1∶1，m/m）的微观图像上没有观察到凝聚体的出现，表明SPI和TFP处于共溶状态。此时SPI-TFP混合液的粒径分布图可观察到2 个散射强度相对相等的峰，与SPI溶液的峰形相差不大，表明SPI与TFP之间没有形成凝聚体。pH 6.0时，SPI储备液和SPI-TFP混合液均开始出现微小颗粒。SPI颗粒的形成是由于蛋白质的自聚集；SPI和TFP开始形成可溶性复合凝聚体。与SPI储备液相比，此时SPI-TFP混合液中峰的数目减少，且粒径分布更为集中。pH 5.0接近SPI的等电点，此时SPI储备液中观察到致密且团聚的SPI聚集体，粒径分布表现为一个窄而尖的峰。SPI-TFP此时处于不溶性复合凝聚体的形成区，因而能观察到较多微小颗粒。
7、SPI-TFP凝聚体流变学特性分析
pH值及质量比对SPI-TFP复合体系黏度的影响
由图8a可知，随着剪切速率的增大，不同pH值的SPITFP混合液（1∶1，m/m）及SPI储备液（pH 6.4）表现出剪切稀化行为，即黏度随着剪切速率的增大而减小，呈典型的非牛顿流体特征。黏度减低的原因是随着剪切速率的增大，复合凝聚体分子间的连接被削弱甚至被破坏导致黏度降低。pH 3.0时，SPI-TFP混合液的总体黏度最高，表明此时两者的相互作用最强，复合凝聚体趋于聚集络合，体系黏度较大。pH 6.0时，由于蛋白与多糖均带负电荷，在体系中存在静电斥力，对流体流动的趋势具有较大的阻碍作用，所以此时SPI-TFP混合液的黏度较高。
如图8b所示，随着TFP添加比例的增大，SPI-TFP混合液的总体黏度逐渐增大。这是因为在较高的多糖浓度下，分子链间的相互作用增加，从而使溶液的黏度增加。斯托克斯定律表明，在一定程度上，体系较高的黏度能减少分子间的运动，会延缓两相分离，提高体系的稳定性，这表明添加适量的TFP，能提高复合体系的稳定性。
质量比和离子浓度对SPI-TFP复合体系黏弹性影响
如图9a所示，整个测定过程中，G’始终大于G”，表明凝聚体都表现出弹性大于黏性的流变学特性，在SPI/壳聚糖凝聚体、罗勒籽胶/β-乳球蛋白中也有类似的发现。2 种聚电解质形成的凝聚体的流变学性质依赖于其分子间相互作用的强度，越强的相互作用会导致越强的黏弹性质。
如图9b所示，当剪切频率为10 Hz，NaCl浓度为20 mmol/L时，G’和G”值达到最大值，当盐浓度大于20 mmol/L时，G’和G”降低。即盐离子浓度为20 mmol/L时，对SPI和TFP复合的促进作用最大，当盐离子浓度大于20 mmol/L时，盐离子开始抑制SPI与TFP之间的相互作用。这些结果与浊度和Zeta电位随离子强度的变化一致。
结论
结果表明：pH值、SPI与TFP质量比和盐离子浓度对凝聚体的形成影响较大，当SPI∶TFP＞1时，与复合物形成相关的关键pH值（pH c 和pH φ1 ）向高pH值方向移动。当SPI∶TFP＜1时，pHφ1向低pH值方向移动。随着体系中TFP比例的增大，浊度的最大吸收峰逐渐降低（pH opt 逐渐减小）。当SPI∶TFP＝1∶1时，两者在pH 3.0处的相互作用最强，此时体系总体的黏度最大（约为1.30 Pa·s），形成的聚集体最多且粒径最大。NaCl浓度较低（＜20 mmol/L）时能促进SPI-TFP凝聚体形成，NaCl浓度较高（≥20 mmol/L）时由于屏蔽作用会抑制凝聚体的形成。当剪切频率10 Hz、NaCl浓度20 mmol/L、SPI与TFP质量比1∶1时，体系具有最高的黏弹性模量，储能模量为9.24 Pa，损耗模量为3.40 Pa。本研究为TFP在植物蛋白饮料中的开发和应用提供了一定理论基础。
本文《银耳多糖与大豆分离蛋白的相互作用及流变性》来源于《食品科学》2022年43卷16期160-168页，作者：龙慧，李祎，朱叶力，滕建文，夏宁。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210906-077。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及摄图网。
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