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我国盛产茶叶，云南以“茶叶的故乡”而闻名。云南种植的大叶种茶，具有芽叶肥厚、叶质柔软等优点，是制作茶产品的优良原料。由于茶叶种植规模的不断扩大，市场上低级茶产品的存量持续增多。低级茶产量大，品质不佳，销售价格低，严重损害了茶农和茶产业的经济效益。筛选有益菌种，采用发酵的方法改善低级茶产品质量，优化茶产品类型，将为低级茶高值化利用起到积极作用。
昆明理工大学农业与食品学院的赵宏朋、胡永丹*、易伦朝*等以湖南白沙溪茯砖茶为菌种来源，在对茯砖茶中优势菌种进行分离、纯化、鉴定的基础上，采用液态发酵方法，将纯化后的菌株用于云南大叶种低级绿茶浸提液的发酵，并对发酵前后发酵液中主要成分的含量变化进行分析。本研究可为云南大叶种低级绿茶发酵菌种的筛选及发酵工艺的优化提供理论依据，为低级绿茶的高值化利用提供技术支撑。
1、茯砖茶优势菌株的分离鉴定
形态学鉴定结果
如图1所示，菌株J1在PDA培养基上生长缓慢，形状不规则，边缘呈淡黄色，中央呈橙黄色，菌落稀松，中央隆起，少量色素扩散于培养基中；在孟加拉红培养基上生长略快，形状不规则，淡黄色至黄褐色，大量色素扩散于培养基中。菌株J2在PDA培养基上生长快，边缘呈白色至淡黄色，中央呈橄榄褐色，菌落致密，色素扩散于培养基中；在孟加拉红培养基上生长较快，中央呈黑褐色，并伴随有大量油状液滴。菌株J3在PDA培养基上生长快，整体呈淡黄色，菌落致密、平伏；在孟加拉红培养基上，中央呈淡黄褐色。菌株J4在PDA培养基上生长快，边缘稀松呈白色至橙黄色，中央呈黄褐色，菌落致密；在孟加拉红培养基上，边缘呈白色至橙黄色，中央呈淡黄褐色，平伏带略微隆起。
菌株通过染色在光学显微镜下的特征形态如图2所示，菌株J2、J3、J4均发现有性结构子囊果，子囊果呈球形或近球形，子囊果容易破裂释放出子囊孢子；菌丝均带有隔膜。菌株J1同样发现有隔菌丝，带有顶囊、分生孢子梗、足细胞等结构。
ITS序列比对结果
如图3所示，4 株菌的ITS序列大小约500～750 bp，且均呈现单一、明亮的条带，表明分离得到的4 株菌DNA纯度较高、无污染。经过双向基因测序、拼接，最终获得菌株J1、J2、J3、J4的ITS序列。将4 株菌序列分别在NCBI数据库中进行同源序列搜索比对，结合形态学鉴定结果，综合鉴定菌株J1为谢瓦曲霉；菌株J2、J3、J4均为冠突曲霉。
2、低级绿茶浸提液发酵前后成分变化
茶多酚类总含量变化
如图4所示，经4 株优势菌单一液态发酵后，茶多酚含量显著降低（P＜0.05）。与空白对照组相比，谢瓦曲霉J1发酵液中茶多酚含量降低了78.94%，冠突曲霉J2、J3、J4发酵液中茶多酚含量分别降低了75.06%、77.06%、74.61%。结果表明，谢瓦曲霉和冠突曲霉发酵均能让云南大叶种茶中多酚类物质发生明显转化，且谢瓦曲霉的转化能力略强于冠突曲霉。
总黄酮含量变化
黄酮类化合物具有柔和的涩感，是茶叶品质的一个重要影响因子，其含量的高低与茶汤的色泽、滋味密切相关。黄酮类物质的减少有助于茶汤滋味的醇化和改善茶汤色泽。如图4所示，经过不同菌株发酵，与空白对照组相比，总黄酮含量分别降低了13.4%（J1）、30.6%（J2）、38.0%（J3）、33.9%（J4）（ P ＜0.05）。发酵液汤色由原来的暗绿淡黄逐渐变得橙黄明亮。
总生物碱含量变化
生物碱是茶叶中的主要活性成分之一，不仅决定着茶叶的品质，还存在一定的有益作用。如图4所示，与空白对照组相比，谢瓦曲霉J1发酵液总生物碱含量略微增加，冠突曲霉J2、J3、J4发酵液降低（ P ＜0.05）。冠突曲霉能有效减低总生物碱含量，这与前人研究结果基本一致。
pH值和可溶性固形物含量的变化
pH值是茶叶发酵过程稳定的一项重要参数。冠突曲霉J2、J3、J4发酵液pH值与空白组接近，而谢瓦曲霉J1发酵液pH值显著降低（ P ＜0.05）。可溶性固形物在茶叶浸提液中的含量越高，对浸提液的纯度以及透明度的影响越大。如图4所示，与空白对照组相比，通过4 株优势菌株发酵后，茶叶浸提液中可溶性固形物含量均显著降低（ P ＜0.05），且不同菌株之间对可溶性固形物的利用差异较小。
咖啡碱、茶氨酸和儿茶素含量的变化
由表1可知，与空白对照组相比，在不同菌株作用下，在茶叶浸提液中咖啡碱、茶氨酸和儿茶素含量均显著变化（P＜0.05）。咖啡碱与总生物碱的含量变化趋势一致；茶氨酸含量在冠突曲霉J2发酵液中显著减少。作为茶多酚主体成分的儿茶素，又分为酯型儿茶素与非酯型儿茶素。
氨基酸含量的变化
由表2可知，云南大叶种低级绿茶中氨基酸组分含量在不同菌株作用下与空白对照组相比有显著变化（P＜0.05）。牛磺酸含量通过谢瓦曲霉J1发酵后显著增加，缬氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下显著增加；酪氨酸在冠突曲霉J4发酵液中未检测到。在冠突曲霉J2、J4发酵液中还未检测到胱氨酸、苯丙氨酸，这可能由于冠突曲霉J2、J4分泌苯丙氨酸解氨酶所导致。
茶色素
由图5可知，与空白对照组相比，在谢瓦曲霉J1及冠突曲霉J2、J3作用下茶黄素含量显著降低，而在冠突曲霉J4作用下茶黄素含量呈显著增加。这可能由于冠突曲霉J4利用儿茶素氧化聚合形成茶黄素的速率远大于茶黄素进一步转化的速率，促使茶黄素的积累。不同菌株发酵液中茶褐素含量均显著增加，茶褐素含量分别是发酵前的1.7、2.0、1.9、2.2 倍，具有显著差异（P＜0.05）。
结 论
对湖南白沙溪茯砖茶中的优势菌株进行分离和鉴定，分别得到谢瓦曲霉J1、冠突曲霉J2、J3和J4 4 种菌株。以云南大叶种低级绿茶为原料进行单一菌株发酵分析，发现经过4 株菌发酵后茶叶浸提液中茶多酚含量较空白对照组分别降低了78.94%、75.06%、77.06%、74.61%，总黄酮总量分别减少13.4%、30.6%、38.0%、33.9%，均显著降低；与未发酵相比，总生物碱在谢瓦曲霉J1作用下显著增加，在冠突曲霉J2、J3、J4作用下显著降低；各菌株发酵液中咖啡碱含量与总生物碱含量变化趋势相同，茶氨酸显著降低，儿茶素各组分的含量变化差异较大，其中酯型儿茶素均呈显著下降趋势，而EC、GC、EGC 3 种非酯型儿茶素均显著增加；氨基酸组分经过菌株发酵有显著变化，在谢瓦曲霉J1发酵后牛磺酸含量显著增加，缬氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下显著增加；J2、J4组中未检测到酪氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的具体原因有待进一步深入研究；茶黄素在谢瓦曲霉J1和冠突曲霉J2、J3作用下显著减少，冠突曲霉J4则显著增加；茶褐素含量均显著增加。
本文《茯砖茶优势菌株分离鉴定及发酵低级绿茶分析》来源于《食品科学》2022年43卷6期89-95页，作者：赵宏朋，黄斯晨，施丽娟，王奕琦，任达兵，胡永丹，易伦朝。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210415-211。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
图片来源于文章原文及百度图片。
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